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in situ RNA-seq

今回の論文
Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ.
Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, Kalhor R, Yang JL, Ferrante TC, Terry R, Jeanty SS, Li C, Amamoto R, Peters DT, Turczyk BM, Marblestone AH, Inverso SA, Bernard A, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM.
Science. 2014 Feb 27


簡単に言うと
細胞内でRNAのシーケンシングをすることに成功しましたという話。

背景として、
RNAはタンパク質を作るための仲介産物であるとともに、スプライシングバリアントで遺伝子の多様性を高めたり、ncRNAはそのまま機能的に働いたり、重要な役割があります。そのため、どの程度あるかだけでなく、細胞内のどこにあるかという情報も非常に重要になります。これまでにもin situ hybridizationという方法で空間的な分布は調べられてきましたが、一度に調べられるのは数個の遺伝子が限界です。今回、これを克服するためにFISSEQ(fluorescent in situ RNA sequencing)という方法を開発しました。この方法はrolling circle amplification (RCA)という方法を使用しています。 RCAは環状になったDNAに、phi29という鎖置換作用のあるDNAポリメラーゼを使うことで、等温でDNAを増幅し続ける方法です。この方法を傷を受けて修復中の皮膚の細胞やハエの胚に対して行っており、同時に大量のRNAの位置と量を同時に調べることができました。

具体的には、
基本的にはおもに方法論の論文なので、方法について詳しく説明する。まずは細胞を固定後ペプシンでたんぱく質を除去し、、ランダムプライマーでRNAの逆転写を行う。この時にアミノアリルdUTPを取り込ませる。BS(PEG)9でアミノアリルdUTPどうしをクロスリンクさせ、その後RNase処理、ligase処理で環状cDNAにする。強いシグナルを得るために、phi29とRCA用プライマーにより、環状cDNAを増幅させる。あとはSOLiDと同じようにライゲーション、画像の取り込み、不要な部位の削除を繰り返していく。
ただ、たくさんの細胞について調べるために広視野で撮影すると、粒子一個一個を判別できなくなってしまうので、partition sequencingという方法を用いている(いまいちよくわからない)。
RNA-seqと比較すると相関係数は0.5-0.7程度。

個人的には、
読んでて難しいと感じた。普段SOLiDは使わないし、原理に関しても忘れてた部分もあった。でもこの実験手法はすごいと思う。装置を作るのも大変だろうし、簡単にはまねできないだろうけど。クロマチンにくっつくncRNAでもシーケンスできるのか?Xistみたいなのは近い距離にたくさん密集してるだろうし、定量は難しいかもね。ただでさえRNA-Seqとの相関はあまり高くないし。でも恐るべしWyss instituteだな。
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